СТРУКТУРНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В ОБЛУЧЕННЫХ МАКРОМОЛЕКУЛАХ

СТРУКТУРНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В ОБЛУЧЕННЫХ МАКРОМОЛЕКУЛАХ

Повреждения, возникающие в структуре облученной макромолекулы, могут привести к изменению ее биологических свойств. Поэтому важнейший этап биофизического анализа механизмов инактивации макромолекул ионизирующим излучением состоит в выявлении всех типов структурного повреждения молекул, выяснении природы процессов, приводящих к данному типу повреждения, и в установлении причинно-следственной связи между типом структурного повреждения и характером изменения биологических свойств макромолекулы. Эти вопросы изучены все еще недостаточно.

Анализ структурных повреждений, возникающих в облученной макромолекуле, представляет сложную экспериментальную задачу, требующую использования высокочувствительных методов анализа.

Структурные повреждения, выявляемые в облученных нуклеиновых кислотах. При облучении сухих препаратов ДНК возникает ряд структурных повреждений, которые удается количественно оценить, как правило, при использовании высоких доз излучения, порядка 104 Гр. Это значительно превосходит значение дозы £>37 для различных типов инактивации. Не исключено, что в действительности инактивация нуклеиновых кислот возникает в результате единичных повреждений, например вследствие разрушения нескольких нуклеотидов. Однако ни одним из современных методов анализа не удается обнаружить столь незначительные повреждения среди десятков тысяч нуклеотидов, составляющих полинуклеотидную последовательность ДНК или РНК.

Для выявления структурных повреждений нуклеиновых кислот испот>зуют различные методы измерения молекулярной массы облученного препарата (седиментационный анализ, изменение све торассешшя, осмоса, характеристической вязкости и т. д.), так как молекулярная масса ДНК или РНК изменяется вследствие двухнитевогЬ разрыва или из-за возникновения сшивок между молекулами. «Если разрыв произошел только в одной из цепей ДНК, то снижение молекулярной массы выявляется после щелочной денатурации или нагревания до 90°. Количественно число однонитевых разрывов определяют с помощью фермента фосфо-моноэстеразы, который отщепляет неорганический фосфат от всех концевых монофосфоэфирных групп (возможное место разрыва), а количество отщепившегося фосфата измеряют фотометрически. Влияние облучения на число водородных связей в молекуле оценивают по степени ее денатурации, например сопоставив количество кислоты, необходимое для денатурации нативной и облученной ДНК (электрометрическим титрованием). Один из способов определения степени денатурации ДНК основан на использовании гиперхромного эффекта (коэффициент оптического поглощения нативной ДНК примерно на 30% ниже, чем для одиночной цепи или смеси соответствующих нуклеотидов): возрастание коэффициента оптического поглощения облученной ДНК указывает на ее денатурацию. Еще один метод выявления денатурированных участков основан на хроматографическом отделении неповрежденных молекул от молекул, имеющих денатурированные участки. Разрушение азотистых оснований в облученной нуклеиновой кислоте можно обнаружить с помощью специфических химических реакций или по уменьшению оптического поглощения.

Использование перечисленных и ряда других методов позволило установить, что в результате облучения сухих препаратов ДНК возникают следующие типы структурного повреждения макромолекулы:

1 — одно- и двухнитевые разрывы;

2 — межмолекулярные поперечные сшивки полинуклеотид-

ных цепей;

3 — разветвленные цепи вследствие суммарного эффекта оди

ночных и двойных разрывов (за счет присоединения обломков молекулы, образовавшихся в результате двойного разрыва, к местам одиночных разрывов в цепи ДНК).

Результаты одного из экспериментов по определению одно- и двухнитевых разрывов в ДНК приведены на рис. III-13.

Одиночные разрывы нити ДНК и разрывы в комплементарных участках обеих нитей пропорциональны поглощенной дозе излучения. Это означает, что двойной разрыв вызывается одиночным событием потери энергии, а не случайным ‘Совпадением двух соседних однонитевых разрывав (в противном случае кривая В2 имела бы иной вид). Вероятность двойного разрыва возрастает с увеличением ЛПЭ-излучения). Так, при облучении ускоренными ионами аргона ДНК из фага Т7 однонитевые разрывы встречаются только в 2—3 раза чаще двухнитевых» в то время как для у-облучения это отношение достигает 5 иля 6.

После облучения сухой ДНК возникают -не только/разрывы полинуклеотидных нитей, но и сшивки между ними (ийс. III-14). Г1о сравнению с контрольными образцами максиму^! коэффициента седиментации облученной ДНК сдвигается в область меньших значений, т. е. молекулярная масса основной части облученного препарата снижается вследствие одиночных и двойных

СТРУКТУРНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В ОБЛУЧЕННЫХ МАКРОМОЛЕКУЛАХРис. 111—14. Профиль седиментации ДНК тимуса теленка при облучении сухих препаратов в вакууме в дозе 3-10* Гр. (по Хагену, Вельстейну, 1965)

СТРУКТУРНЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В ОБЛУЧЕННЫХ МАКРОМОЛЕКУЛАХ

Рис. 111—13. Однонитевые (Bi) н двухнитевые (Вг) разрывы в сухой ДНК тимуса теленка при рентгеновском облучении в вакууме (по Хагену, Вельстейну, 1965)

разрывов. Однако наряду с этим наблюдается небольшой пик в области 30—50 5, который не отмечен в контрольном образце. Эта фракция возникла вследствие сшивок между полинуклеотид-ными тяжами ДНК.

Механизм возникновения структурных повреждений ДНК в результате поглощения энергии ионизирующего излучения выяснен недостаточно. Работы в этом направлении интенсивно проводятся в настоящее время. Болыпо число исследований посвящено анализу начальной стадии химических изменений в облученных нуклеиновых кислотах, для которой характерно .появление -свободных радикалов. Методом ЭПР-спектроскопии .изучают выход и структуру радикалов, возникающих при облучении свободных азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов. Сопоставление этих спектров с .наблюдаемыми при облучении сухой ДНК позволяет ,в ряде случаев идентифицировать радикалы, определяющие спектр облученных нуклеиновых кислот. Один из компонентов сигнала ЭПР облученной ДНК — радикал тимина, образованный, по мнению ряда авторов, продуктом присоединения атомарного водорода к Сб-атомам тимина. Аналогичной эффект можно продемонстрировать при действии на порошкообразный образец атомарным водородом, полученным при тазовом разряде: образующиеся сигналы ЭПР сходны с наблюдаемыми в облученных иуклеотидах и препаратах ДНК. При облучении атомарный водороДч отщепляется от остатка дезокоирибозы, радикалы которой обрадуются посредством утраты атома водорода и раскрытия кольца. \

В биофизических исследованиях последних лет анализируется роль эффектор миграции энергии в пределах двухнитевой ДНК или между молекулами. Ряд данных указывает на возможность, передачи энергии от одной цепи к другой посредством системы водородных связей. Так, при облучении при 77К 1 : 1—кокри-сталла, состоящего из 9-метиладенина и 1-метилтимина, обнаружили неспецифичесмин сигнал ЭПР. После нагревания образца до комнатной температуры спектр приобретал характерные очертания радикала тиминового кольца. Обработанная таким образом эквимолярная смесь указанных соединений давала сигнал ЭПР, характерный для суммарного спектра аденина и тимина. Этот опыт свидетельствует о переносе энергии или спина через водородные мостики в кокристалле от аденина к тимину. В облученной ДНК также наблюдают ярко выраженный сигнал тимина и слабый — аденина. О существовании внутримолекулярного переноса спина в облученной ДНК свидетельствует изменение сигнала ЭПР при нагревании облученных образцов от 77 К до комнатной температуры. Анализ форм спектра, полученного-при комнатной температуре, показывает, что он не образуется простым наложением первичного спектра отдельных составных частей ДНК, а на него оказывают влияние эффекты перестройки.

Интересные данные о механизме возникновения структурных повреждений в облученной ДНК получены в экспериментах с использованием модифицирующих агентов (см. гл. VI).

Структурные повреждения облученных ферментов! Большинство исследований выполнено на белках с известной первичной структурой. Это позволило выявить тонкие различия облученных и нативных препаратов.

Анализ структурных повреждений, возникающих в облученных препаратах рибонуклеазы, показал, что при дозах, близких к 1>37, наблюдается:

— изменение аминокислотного состава. Заметнее всего в образцах снижалось содержание 6 аминокислот: метионина^ фенилалакина, лизина, гистидина, тирозина и цистина;

— нарушение третичной структуры макромолекулы, оцениваемое по изменению оптического поглощения и оптического вращения, доступности остатков тирозина, степени переваривания белка трипсином и т. д.;

— возникновение разрывов полипептидной цепи, приводящее к появлению свободных амидных групп и фрагментов молекулы;

— появление агрегатов, о наличии которых судили по изменению константы седиментации и скорости элюции

при хроматографии на сефадексе;

— разрыв сульфгидрильных связей и появление свободных SH-npynn.

При облучении лизоцима обнаружен несколько иной характер структурных повреждений:

|— изменяется конформация макромолекулы;

— появляется несколько компонентов, обладашщид ферментативной активностью;

— не обнаруживаются изменения в аминокислотном составе макромолекулы.

Исследование структурных повреждений облученного химо-трипсина показало, что поглощение энергии ионизирующих излучений вызывает:

— появление новых хроматографичеоких пиков при элюции облученного препарата. Эти фрагменты утратили ферментативную активность;

— возникновение конформационных изменений, выявляемых по изменению оптического вращения и уменьшению проч-носвязанных амидных атомов водорода;

— разрушение аминокислотных остатков серина и триптофана (в среднем одна молекула серина и одна триптофана на молекулу фермента при дозе /?з7);

— снижение способности связывать субстрат активным центром.

Структурные повреждения, о которых говорилось выше, наблюдаются после облучения в дозе, меньшей или равной /?37, т. е. в случаях, когда в среднем каждая молекула испытывает только одно событие попадания (ом. «одноударные» кривые инактивации, гл. II). В диапазоне больших доз картина существенно усложняется за счет возникновения повторных актов взаимодействия, вызывающих дополнительные повреждения.

Сложность построения реальной картины возникновения структурных повреждений в облученных белках заключается прежде всего в том, что необходимо выявить те физико-химические процессы, в результате которых одиночное событие потери энергии в пределах белковой молекулы, т. е. поглощение структурой около 60 эВ, вызывает ее генерализованное повреждение, такое, как изменение конформации. Следует также объяснить причину селективного поражения отдельных структурных звеньев, например только шести аминокислот в первичной структуре рибонуклеазы, или серина и триптофана в молекуле химотрипси-на. Первичное событие абсорбции энергии носит вероятностный характер, т. е. любая из аминокислот с равной вероятностью поглощает энергию излучения, а конечное структурное поражение локализуется в специфических участках. Для объяснения этого эффекта, вероятно, необходимо допустить возможность миграции энергии и заряда по полипептидной цепи вплоть до локализации в определенном структурном звене.

Исследования, которые проводятся в последние годы, посвящены идентификации свободнорадикальных состояний, возникающих в облученных белках. Для этого используются ЭПР-сгтектро-скопия .и* другие специальные методы анализа. Установлено, что после облучения сухих ферментов три температуре 77 К на спектрах ЭПР обнаруживается недискретный оинглет. При нагревании образцов до комнатной температуры спектр ЭПР представляет собой уже спектр вторичных радикалов, состоящих из дублета (возможно, а-углеродных радикалов) и сложного спектра радикалов серы (рис. III-15). Дальнейший анализ должен установить роль наблюдаемых вторичных радикалов в появлении конечных структурных повреждений и в эффекте инактиваций фермента. Перспективным для этого может оказаться использование модифицирующих агентов, т. е. воздействий, способных изменить характер возникающих радикальных продуктов. Например, если эти агенты параллельно изменяют и спектр ЭПР вторичных радикалов, и характер структурных изменений в ферменте, то можно предположить причинную связь между появлением вторичных радикалов и потере» ферментативной активности облученными молекулами.

Рис. Ill—16. Корреляция между потерей ферментативной активности^ поражением активных центров и кон-формационными изменениями химо-трипсина, облученного у-дучами I37Cs (по Толберту, 1966): 1 — остаточная ферментативная активность; 2 — оставышеся непораженными ак-Для локализации радикалов, тивные центры; 3 — изменение кои-возникающих в полипептидной формации, определяемое но оптиче-цепи после облучения, применя- скому ВР™ИЮ Ь

ют метод, основанный на использовании тритироваиного сероводорода. Образованные облучением радикалы должны взаимодействовать с 3H2S согласно уравнению

Помещая облученную рибонуклеазу в атмосферу 3H2S и далее подвергая ее гидролизу, устанавливают, в каких аминокислотах содержится радиоактивная метка (3Н), т. е. определяют/локализацию возникших радикалов. Опыты показали, что тритий включался (в убывающем количестве) в лизин, метионий, лролнн, гистидин; в небольших концентрациях тритий обнаруживался в фенилаланине, изолейцине и валине. В общем, это соответствует количественному распределению поврежденных аминокислот в облученной РНКазе.

Рис. III—17. Свободнораднкальиая модель радиационной инактиваций сухих ферментов (по Хенриксену, 1966): I — спектр первичных продуктов; II — процессы, протекающие на физико-химической стадии; III — образовавшиеся промежуточные продукты; IV, V — конечный эффект — инактивация фермента

При комнатной температуре в облученных молекулах всех еще содержится много нестабильных продуктов. При растворении фермента (необходимом для определения его активности) нестабильные промежуточные продукты превращаются в стабильные пораженные структуры. Это может быть связано с реакцией белковых радикалов или лабильных химических связей с водой либо с увеличением подвижности в растворе отдельных полипептидных цепей. В опытах с рибонуклеазой было показано, что растворение облученной молекулы приводит к ее денатурации. Появление свободных амидных групп и фрагментов после раскручивания облученных белков указывает на существование замаскированных разрывов полипептидной цепи. В случае с лизоци-мом при дозе 300 кГр не обнаружено изменения аминокислотного состава (Z?37 инактивации — 266 кГр). Однако выявлены конформационные изменения. Вероятно, они и приводят к инактивации.

В случае с химотрипсином нет единства взглядов на роль отдельных структурных нарушений в эффекте инактивации. Данные на рис. 111-16 свидетельствуют о параллелизме между инактиви-рующим действием излучения, возникновением конформационных изменений в облученной молекуле и потерей способности связывать субстрат активным центром. Эти результаты объясняют по-разному. Первое объяснение состоит в том, что поглощение энергии излучения приводит к нарушению конформации белковой молекулы; это, в свою очередь, вызывает изменение конформации активного центра и его способности связывать субстрат и, как следствие, инактивацию фермента. Другая точка зрения основана на том, что один сериновый и (или) тргаптофановый остаток в особом участке ‘химотрипоина, например в активном центре, более радиочувствителен, чем такие же аминокислоты в других участках ‘белковой молекулы. При дозе в среднем на одну молекулу фермента разрушается *по одному сериновому и тр.ип-тофановому остатку; если эти ключевые аминокислоты регулируют конформацию активного центра, то их ‘разрушение приведет к поражению активного центра и, тем самым, к инактивации химотрипсина.

Схема отдельных этапов лучевой инактивации сухих ферментов приведена на рис. III-17. Она нуждается в дальнейших уточнениях.

В последние годы особое внимание уделяют анализу скрытых повреждений, возникающих в облученных белках, и изучению механизмов миграции энергии в макромолекулах.