Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты

Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты

Существуют определенные трудности количественного измерения степени инактивации нуклеиновых кислот. Ниже перечислен ряд модельных систем, -которые позволяют количественно оценить важнейшие из функциональных характеристик этих макромолекул, и перечислены основные феноменологические данные, полученные при изучении характера инактивации облученных нуклеиновых кислот.

Инфекционность облученных нуклеиновых кислот была изучена в экспериментах с ДНК и РНК, изолированных из бактериофагов. Термином «инфекционность» обозначают способность вирусной ДНК или РНК индуцировать образование бактериальной клеткой новых полноценных фагов. Методически эксперимент выглядит так: бактерии обрабатывают лизоцимом, и они теряют часть клеточной стенки — образуются сферопласты, которые можно инфицировать нуклеиновой кислотой, выделенной из бактериофага. Если в инфицированной бактерии возникают новые полноценные фаги, то бактериальная стенка разрывается и из лизировавшей бактерии высвобождается 100—200 бактериофагов; количество вирусных частиц, высвободившихся из лизированных сферопластов, в определенных пределах пропорционально количеству молекул ДНК или РНК, сохранивших инфекционные свойства. Так как высвободившиеся фаги лизируют новые сферопласты вблизи места своего возникновения, то на сплошном газоне бактериальных клеток, выращенных на агаре, образуется пятно лизиса — «бляшка» (количество бляшек можно подсчитать визуально), — их число служит количественным критерием инфекционности вирусной нуклеиновой кислоты. Этим методом определяют инактивацию вирусной ДНК в результате облучения. Результаты одного из таких экспериментов приведены на рис. III-3.

Доля молекул ДНК, сохранивших инфекционность, отложена по оси ординат в логарифмическом масштабе, все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. In N/N0=—kD, кривая «доза—эффект» экспоненциальна.

Трансформирующую активность бактериальной ДНК можно оценить по появлению специфических генетических маркеров у бактерий-реципиентов, «поглотивших» трансформирующую ДНК донора. Например, извлекают ДНК из бактерии, устойчивой к стрептомицину, и в ее присутствии инкубируют стрептомицинчув-ствительных мутантов. Если в результате рекомбинации произошло встраивание специфической последовательности нуклеотйдов ДНК донора в геном реципиента, т. е. мутанты стали устойчивы

Таблица HI-l

Радиочувствительность функций, определяющих биологическую активность ферментов

(по Окада, 1972)

Фермент Радиочувствительность функций, связанных с ферментативной активностью (сопоставляются соответствующие величины доз D3?)
.Химотрипсин Трипсин

Глутаматдегидрогеиаза

Рибонуклеаза

Аспартаттранскарбамо-илтраисфераза

зстераза протеаза связывание диизопропилфосфата ]> уменьшение максимальной скорости увеличение константы Михаэлиса — Ментен* протеаза эстераза

уменьшение максимальной скорости и увеличение константы Михаэлиса — Меитен поражение активного центра и способности связывать кофермент уменьшение максимальной скорости; константа Михаэлиса — Меитен без изменения поражение активного центра > инактивация участка инги-бироваиия по принципу обратной связи (аллостерические свойства)

* Более высокая радиочувствительность (т. е. меньше дозы D37) обозначена символом >. Например, эстераза > протеаза означает, что эстеразиая активность фермента более радиочувствительна, чем протеазиая.

лучение приводит к снижению максимальной скорости реакции, а величина константы Михаэлиса—Ментен остается без изменения. Это означает, что число каталитически активных молекул снижается -в облученном препарате, однако пораженные молекулы сохраняют сродство к субстрату. Вероятно, возникающие структурные поражения затрагивают активный центр, но не препятствуют взаимодействию фермента со специфическим субстратом. В случае с трипсином протеазная активность поражается в большей мере, чем эстеразная, т. е. в результате облучения возникают повреждения главным образом в тех структурных звеньях, которые определяют протеазную активность фермента. Если ионизирующие излучения в состоянии вызывать специфические структурные повреждения в молекуле фермента и приводить к определенному изменению его функциональных характеристик, то с помощью радиационного воздействия можно исследовать причинную связь между структурой и функцией фермента.

Рассмотрение феноменологии лучевого поражения ферментов позволяет заключить, что в результате прямого действия излучения возникают различные нарушения функциональных свойств фермента; наблюдается экспоненциальная зависимость биологического эффекта от величины поглощенной дозы, т. е. с увеличением поглощенной дозы излучения доля макромолекул, сохранивших нативные свойства, убывает по закону e~hD, где k — константа, a D — поглощенная доза. Облученный фермент может утрачивать одни функциональные свойства при сохранении других, т. е. наблюдается неодинаковая радиочувствительность различных биологических свойств фермента; по одному и тому же критерию, например каталитической активности, различные ферменты обладают неодинаковой радиочувствительностью.

Прямое действие излучения

на нуклеиновые кислоты

Существуют определенные трудности количественного измерения степени инактивации нуклеиновых кислот. Ниже перечислен ряд модельных систем, -которые позволяют количественно оценить важнейшие из функциональных характеристик этих макромолекул, и перечислены основные феноменологические данные, полученные при изучении характера инактивации облученных нуклеиновых кислот.

Инфекционность облученных нуклеиновых кислот была изучена в экспериментах с ДНК. и РНК, изолированных из бактериофагов. Термином «инфекционность» обозначают способность вирусной ДНК или РНК индуцировать образование бактериальной клеткой новых полноценных фагов. Методически эксперимент выглядит так: бактерии обрабатывают лизоцимом, и они теряют часть клеточной стенки — образуются сферопласты, которые можно инфицировать нуклеиновой кислотой, выделенной из бактериофага. Если в инфицированной бактерии возникают новые полноценные фаги, то бактериальная стенка разрывается и из лизировавшей бактерии высвобождается 100—200 бактериофагов; количество вирусных частиц, высвободившихся из лизированных сферопластов, в определенных пределах пропорционально количеству молекул ДНК или РНК, сохранивших инфекционные свойства. Так как высвободившиеся фаги лизируют новые сферопласты вблизи места своего возникновения, то на сплошном газоне бактериальных клеток, выращенных на агаре, образуется пятно лизиса — «бляшка» (количество бляшек можно подсчитать визуально), — их число служит количественным критерием инфекционности вирусной нуклеиновой кислоты. Этим методом определяют инактивацию вирусной ДНК в результате облучения. Результаты одного из таких экспериментов приведены на рис. III-3.

Доля молекул ДНК, сохранивших инфекционность, отложена по оси ординат в логарифмическом масштабе, все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. lnJV/JV0=—ku, кривая «доза—эффект» экспоненциальна.

Трансформирующую активность бактериальной ДНК можно оценить по появлению специфических генетических маркеров у бактерий-реципиентов, «поглотивших» трансформирующую ДНК. донора. Например, извлекают ДНК из бактерии, устойчивой к стрептомицину, и в ее присутствии инкубируют стрептомицинчув-ствительных мутантов. Если в результате рекомбинации произошло встраивание специфической последовательности нуклеотйдов ДНК донора в геном реципиента, т. е. мутанты стали устойчивы к стрептомицину (генетический маркер), то на среде, содержащей стрептомицин, мутанты будут образовывать колонии. Число колоний пропорционально доли молекул ДНК, сохранивших трансформирующую активность.

На рис. III—4 показаны результаты опытов, в которых изучали трансформирующую активность ДНК после облучения электронами с энергией в 1 МэВ. Для этого сухие споры Bacillus sub-

tilts подвергали облучению, затем выделяли ДНК и инкубировали с клетками, не способными синтезировать индол (генетический маркер); зависимость «доза—эффект» экспоненциальна.

Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты4 8

Доза, Х103Гр

Рис. III—3. Инфекцион-иость ДНК фага фХ174 после облучения препарата у-лучами в0Со в вакууме (.по Юнгу, 1968)

100

Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты

Доза облучения, X 10Л Гр

Рис. III—4. Инактивация трансформирующей ДНК Bacillus sub-tilis при облучении сухих спор электронами с энергией 1 МэВ (по Танукэ и Хатчинсону, 1967)

Затравочная активность ДНК, т. е. ее способность служить матрицей для синтеза комплементарных нитей ДНК или РНК, также служит важным критерием инактивации нуклеиновых кислот ионизирующим излучением. Путем соответствующей постановки эксперимента можно дифференциально оценить способность ДНК служить матрицей для синтеза ДНК или РНК. Для этого облученную ДНК инкубируют в полной ДНК-полимеразной (или РНК-полимеразной) системе, содержащей меченые нуклео-зидтрифосфаты, а затем измеряют индекс метки в кислотонерасг-воримой фракции. Интересно, что для подавления способности молекул ДНК служить матрицей для синтеза ДНК необходима доза облучения, в 40 раз меньшая, чем для синтеза комплементарных РНК. Это можно объяснить, если учесть, что в первом случае транскрибируется вся матрица, а во втором — только ее ограниченные участки.

Способность ДНК образовывать гибриды с иРНК также позволяет количественно оценить инактивацию ДНК в результате облучения. Для проведения такого эксперимента получают РНК, меченную радиоактивным фосфором, затем ее смешивают с предварительно облученной ДНК и инкубируют смесь в определенных

Таблица Ш-2

Сравнительная радиочувствительность различных тРНК, (способность связывать соответствующие аминокислоты)

(по данным Сэтлау и др., 1964)

Изученный комплекс: аминокислота/тРНК £3„ XIC Гр Изученный комплекс: аминокислота/тРНК 2>3„ Х10« Гр
Лейшш 25 Пролии 58
Алании 43 Метионии 62
Изолейцин 46 Валин 86

условиях. В ряде опытов изучали торможение образования гибридов ДНК—РНК после рентгеновского облучения ДНК из Е. coli В (препарат иРНК выделяли из того же объекта). Молекула иРНК воспринимала ДНК как «комплементарную», даже если она уже содержала несколько индуцированных облучением повреждений; только после накопления определенного числа повреждений резко снижалась способность облученной ДНК образовывать гибриды с иРНК.

Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты

Доза облучения, X10′ Гр

Рис. III—5. Инактизация сухих препаратов тРНК электронами с энергией 1 МэВ (по Сэтлоу и др., 1964). 1, 2, 3, 4, 5, 6 — соответственно комплексы лейцина, аланииа, изо-лейцина, пролина, метионина и валина со специфическими

тРНК

Способность транспортных РНК связывать соответствующие

аминокислоты можно оценить в специальных модельных системах и, таким образом, количественно оценить их инактивацию ионизирующими лучами. Для этого облучают препарат тРНК и инкубируют его с аминокислотами, меченными по углероду 14С, затем осаждают тРНК и определяют содержание меченых аминокислот в кислотонерастворимой фракции. Результаты такого эксперимента приведены в табл. III-2. Относительную радиочувствительность различных тРНК оценивали по величине дозы Dw — наиболее радиочувствительной оказалась лейциновая тРНК.

Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты1 2 3 Доза облучения, X 103Гр

Рис. Ill—6. Инактивация лиофилизированных рибосом из Е. coli В -у-лучами 80Со (по Кукану, 1966)

Кривые «доза—эффект» для лучевой инактивации тРНК представлены на рис. III-5, из которого видно, что доля молекул, сохранивших способность связывать аминокислоты, экспоненциально убывает с ростом поглощенной дозы излучения.

Функциональную активность рибосом, облученных in vitro, можно оценить по количеству белка, синтезированного в единицу времени в полной системе, содержащей соответствующие иРНК, тРНК и аминокислоты (рис. III-6). Рибосомы выделяли из Е. coli, облучали и инкубировали в системе, содержащей в качестве иРНК полиуридиловую кислоту (поли-У), которая инициирует синтез по-лифенилаланина. Как видно из рис. 111-6, с ростом дозы экспоненциально снижается доля рибосом, сохранивших исходную синтетическую активность.

Таким образом, в модельных системах in vitro можно анализировать инактивацию нуклеиновых кислот и надмолекулярных комплексов, в которые входят эти макромолекулы. В последние годы исследователи уделяют большое внимание изучению радиационного поражения хроматина. Эти эксперименты приближают нас к пониманию реальных процессов инактивации ДНК в клетке.

Прямое действие радиации на молекулы ДНК, иРНК, тРНК и сложные надмолекулярные ансамбли — рибосомы—приводит к утрате их биологических функций, связанных с репликацией, транскрипцией и трансляцией генетического кода. Такого рода эффекты имеют решающее значение при действии радиации на вирусы, бактерии, клетки и сложные многоклеточные системы. Поэтому в настоящее время изучению механизмов инактивации нуклеиновых кислот ионизирующим излучением уделяется большое внимание.

В настоящем разделе описаны некоторые экспериментальные подходы, позволяющие изучать характер инактивации белков и нуклеиновых кислот ионизирующей радиацией. Феномены, наблюдаемые в такого рода экспериментах, отражают заключительный этап лучевого поражения, когда стойкие структурные повреждения уже привели к необратимым изменениям биологических свойств макромолекулы. Эти данные могут служить отправной точкой биофизического анализа механизма инактивации при прямом действии излучения. Биофизический анализ должён воссоздать все предшествующие этапы «размена энергии» излучения, которые в конечном счете и сформировали наблюдаемые функциональные нарушения.