ПЕРВИЧНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, ПРИВОДЯЩИЕ К ИНАКТИВАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ ПРЯМОМ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЯ

ПЕРВИЧНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ,  ПРИВОДЯЩИЕ К ИНАКТИВАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ ПРЯМОМ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЯ

В главе II рассматривался формальный подход, позволяющий на основании экспериментальных кривых «доза—эффект» судлгь о природе первичных событий, приводящих к конечному радиз-биологическому эффекту. В частности, там обсуждались критерии «одноударности» процесса инактивации и перечислялись условия, выполнение которых показывает, что радиобиологический эффект вызван одиночным переносом дискретной порции энергии излучения к мишени, находящейся в пределах объекта.

Рассмотрим, выполняются ли эти условия в случае инактивации белков и нуклеиновых кислот. Первое требование — экспоненциальный характер кривых «доза—эффект». Как указывалось в данной главе, при облучении сухих или кристаллических белков и нуклеиновых кислот эффект облучения экспоненциально зависит от поглощенной дозы радиации. Второе условие — независимость эффекта от мощности дозы и от того, какими частями она сообщалась объекту, — также выполняется на различных изученных системах. О выполнении третьего условия — снижения эффективности излучения с ростом ЛПЭ — свидетельствуют многочисленные опыты, результат одного из которых представлен на рис. Ш-7. Трипсин облучали сравнимыми дозами у-излучения и а-частиц полония (с энергией 5,25 МэВ). Во всем диапазоне исследованных доз у-излучение оказалось примерно вдвое более эффективным: доза £>37 для у-лучей составляла 180 кГр, а для а-частиц — 320 кГр. При одинаковой поглощенной дозе у-излучение генерирует редкорасположенные одиночные ионизации, а а-частицы — плотные колонны ионов, практически непрерывно следующие вдоль трека частиц. Если одиночной ионизации достаточно для инактивации макромолекулы, то а-частицы образуют множество «ненужных» ионизаций в пределах мишени, а большинство редкорасположенных ионизаций, вызванных у-лучами, эффективно и приведет к поражению большого числа молекул.

Если представление об одноударности процесса инактивации макромолекулы справедливо, то, исходя из величины дозы D37, можно определить параметры мишени — ее геометрические размеры и молекулярную массу (ем. уравнение II-8).

Определение параметров мишени проводится на основании следующих рассуждений. Согласно «теории мишени» в случае одно-ударного процесса выполняется соотношение (II-8), т. е. масса мишени обратно пропорциональна величине дозы .D37, выраженной в числе попаданий на грамм:

М=1Д)37[г]. (III-1)

Переход от дозы, выраженной в грэях, к дозе в числе попаданий на грамм осуществляют следующим образом. Согласно определению

1 Гр = Дж-кг_1 = 6,24-1015 эВ-г-1. (III-2)

Энергию одного попадания, т. е. необходимую для возникновения одиночной ионизации или скопления из 2—3 пар ионов, примем равной 75 эВ (на образование пары ионов расходуется 32—34 эВ, а на рой из 2—3 пар ионов — около 110 эВ).

Теперь можно перейти от дозы в грэях к дозе в числе попаданий на один грамм:

1 Гр = 6,24-1015 эВ/г: 75 эВ/попадание = 0,82-1014

попаданий/г. (I II-3)

Зная массу мишени в граммах, ее молекулярную массу легко определить умножением массы на число Авогадро.

На основании экспериментально установленных величин D37 были рассчитаны молекулярные массы мишеней, ответственных за инактивацию большого числа молекул. Во всех случаях, начиная от небольшой молекулы пенициллина, имеющей молекулярную массу около 103 дальтон, и до трансформирующей ДНК массой в 107 дальтон, наблюдается хорошее соответствие между молекулярной массой мишени и истинной молекулярной массой соответствующей молекулы.

Представление о корреляции этих двух групп дает рис. III-8, где по оси абсцисс отложены истинные молекулярные массы молекул, а по оси ординат — молекулярные массы мишеней, ответственных за инактивацию соответствующих молекул. Если отрезки осей равны, то пересечение их проекций дает точку, лежащую на прямой, проходящей под углом 45°, как это в действительности и имеет место.

В большинстве случаев размер мишени близок к геометрическим размерам молекул, т. е. одиночное событие потери энергии в любой точке молекулы приводит к ее инактивации. Этот вывод имеет важное значение. Дальнейший биофизический анализ должен исходить из того факта, что в результате одиночного взаимодействия ионизирующей частицы с молекулой с затратой энергии около 75 эВ молекула белка или нуклеиновой кислоты утрачивает различные функциональные свойства. Между двумя этими событиями — переносом дискретной порции энергии излучения к макромолекуле и ее инактивацией — происходит ряд последовательных физико-химических процессов, которые требуют детального списания.

Представление о вероятностном характере взаимодействия излучения с веществом, в результате которого некоторые атомы или молекулы поглощают дискретные порции энергии, сформировалось в 20-е гг. Оно привело к формулировке принципа попадания в радиобиологии. Однако до настоящего времени не создана строгая теория, позволяющая на основании строения молекулы предсказать вероятность поглощения ею определенного количества энергии ионизирующего излучения, т. е. оценить относительную частоту поглощения различных «энергетических пакетов».

Такие исследования интенсивно проводятся в последнее десятилетие. Наметилось два направления: теоретическое, основанное на квантовомеханических моделях, и экспериментальное, связанное с поиском методов прямого измерения потерь энергии в результате одиночного взаимодействия заряженной частицы с молекулой.

Теория, развитая Бете (см. гл. I), позволяет количественно оценить потерю энергии частицы при ее прохождении в веществе. На основании уравнения (1-14) можно рассчитать дифференциальную потерю энергии частицей определенного заряда, движущейся со скоростью v в веществе данной плотности. Однако величина потери энергии dE/dx еще ничего не говорит о том, какие «энергетические пакеты» переносятся к молекуле. В принципе, передача энергии может происходить за счет двух типов взаимодействия — лобового и скользящего соударения.

Лобовое соударение достаточно точно описывается классической электродинамикой. При этом типе взаимодействия осуществляется «прямое попадание» заряженной частицы в орбитальный электрон, который приобретает необыкновенно большой момент количества движения. Вероятность этого эффекта низка. В 8—10 раз чаще происходит скользящее соударение, которое служит основным типом взаимодействия заряженной частицы с молекулами.

При описании скользящего соударения частица рассматривается как источник электрического поля, в котором содержатся фотоны всех возможных частот. Такое поле может взаимодействовать с орбитальными электронами на значительных расстояниях. В газах это расстояние (прицельный параметр) порядка 100 им, в плотном веществе — около 10 нм. Взаимодействие электрического поля заряженной частицы с молекулой переводит ее в то или иное возбужденное состояние, в том числе и соответствующее ионизации (рис. III-9).

Силу, с которой электрическое поле действует на молекулы, можно разложить на две составляющие: параллельную пути ча-А стицы (продольный компонент) и перпен

дикулярную (поперечный компонент).

Каждый компонент можно изобразить рядом Фурье как сумму чисто гармонических функций времени:

Епоперечн = • COS (2n\it). (111 -4)

Продольный компонент так мал, что им можно пренебречь (частица проходит на значительном расстоянии от молекулы) .

Анализ Фурье-фунКЦИИ ДЛЯ /Гпопереч показывает, что сила поперечного компонента постоянна от низких до почти максимальных частот; каждый интервал частоты включает одно и то же количество энергии фотонов, составляющих поле частицы. Таким образом, действие заряженной частицы (ее электрического по-Рис. III—9 Кривая по- ч а М0лекулу совпадает с действием тенциальнои энергии молекулы, взаимодействующей света источника, дающего равное число с полем заряженной части- фотонов для каждого интервала частот цы (по Сэтлоу и Полларду, от видимого света до рентгеновского из-1964): А — молекула до лучения («белый свет»),

В теории, развитой в 50-е гг. Платц-маном, для характеристики молекулы, взаимодействующей с заряженной частицей, вводится величина «силы осциллятора» этой молекулы, которая выражает вероятность перехода, приводящего к возбуждению или ионизации молекулы.

Силу осциллятора, пропорциональную коэффициенту макроскопического оптического поглощения света соответствующей частоты, обозначают через fs для перехода из основного состояния в дискретное возбужденное состояние s, которое появляется в результате поглощения света частотой vs=Es/h, где Es — энергия молекулы в возбужденном состоянии относительно энергии в основном состоянии (энергия возбуждения). Для переходов внутри непрерывного спектра дискретную силу осциллятора нужно заменить на dfjdv или df/dE, зависящую от энергии E=hv. Обе формы выражения силы осциллятора нужно понимать как величины, усредненные по всем возможным ориентациям молекулы.

П отенциальиая энергия

ПЕРВИЧНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ,  ПРИВОДЯЩИЕ К ИНАКТИВАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ ПРЯМОМ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЯ

Потенциальная энергия

ПЕРВИЧНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ,  ПРИВОДЯЩИЕ К ИНАКТИВАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ ПРЯМОМ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЯ

наложения поля; Б — после взаимодействия с полем; 1 — возбужденная молекула; 2 — ионизированная молекула

Если молекула возбуждается светом источника, дающего равное число фотонов для каждого интервала частот — от видимого света до рентгеновского излучения (белый свет), то число молекул, активированных до состояния s, пропорционально силе осциллятора этого состояния:

7Vs=const-i/s. (III-5)

Уравнение (III-5) показывает, что при постоянном распределении частоты величина Ns пропорциональна силе осциллятора. Если частота падающего света характеризуется распределением lJhvs—lJEs, то число молекул, возбужденных до состояния s прохождением быстрой заряженной частицы, описывается уравнением

Ns~fs/Es. (III-G)

Аналогичное выражение для непрерывного спектра:

N(E)~(df/dE)/E. (III-7)

Уравнение (III-7) называют «оптическим приближением». Основное ограничение этого метода — значительная погрешность при малых значениях fs. Однако применение оптического приближения дает хорошие результаты для анализа энергетического спектра первичных активаций, генерируемых излучением, в действующем спектре которого преобладают быстрые заряженные частицы.

Сила осциллятора fs пропорциональна числу электронов в оболочке, в которой индуцируется активация, т. е. она максимальна для внешних оболочек; Es пропорциональна квадрату эффективного заряда ядра и меньше для внешних оболочек, так как электроны внутренних оболочек экранируют поле ядра. Тогда согласно уравнениям (III-6), (III-7) можно сделать вывод: активация валентных электронов — преобладающий первичный процесс, происходящий в результате прохождения заряженной частицы через вещество.

Если бы существовала возможность теоретически рассчитать силу осциллятора молекулы, то можно было бы предсказать уровни активации молекул в результате взаимодействия с заряженной частицей. Такой расчет, основанный на квантовомеханических представлениях, был проведен лишь для атома водорода. Уже для малых многоатомных молекул эта задача практически невыполнима (не говоря уже о макромолекулах). Оценить спектр сил осциллятора удается на основании косвенных данных, полученных при изучении коэффициентов поглощения в области непрерывного абсорбционного спектра, показателя преломления и оптической дисперсии, сечения неупругого рассеяния электронов и др.

Согласно уравнению (IH-7) в области непрерывного спектра вероятность создания данного возбужденного состояния пропорциональна (df/dE)/E. Представив на основании косвенных данных спектр сил осциллятора многоатомной молекулы, можно для нее построить спектр возбуждения как функцию R(df/dE)/E, константа Ридберга R вводится для единства размерности. При таком определении спектр возбуждения совпадает со спектром первичных активаций, создаваемых заряженной частицей при ее первом столкновении. Анализ спектра возбуждения молекул, состоящих из атомов с Z< 10 и поэтому имеющих кроме валентных электронов только ^-оболочку, показал, что практически все возбуждения сосредоточены в области сравнительно больших значений Е. Непрерывный спектр поглощения молекул, в котором сосредоточена сила осциллятора, содержит в себе непрерывные спектры, обусловленные процессом ионизации и процессом диссоциации, а также спектр, создаваемый процессами, в которых возможна как ионизация, так и диссоциация молекулы, конкурирующие между собой (сверхвозбужденное состояние).

На рис. 111-10 показан спектр возбуждения метана, построенный на основании экспериментальной оценки силы осциллятора молекулы.

Видно, что из всех первичных событий, которые не приводят к’ионизации, 45% составляют сверхвозбужденные состояния. Среднее значение энергии, соответствующее полосе сверхвозбуждения, равно приблизительно 15 эВ, т. е. более чем в 3 раза превосходит энергию диссоциации СНз—Н, равную 4,4 эВ. В этом сверхвозбужденном состоянии существует конкуренция между явлениями ионизации и диссоциации. Часть спектра, обозначенная как «ионизация», соответствует тем уровням возбуждения, которые всегда приводят к ионизации.

Анализ спектров возбуждения показывает, что для большинства органических молекул спектр сил осцилляторов лежит в области примерно 10—30 эВ над основным состоянием. Сила более длинноволновых осцилляторов невелика (исключение составляют молекулы, имеющие двойные и тройные связи: они могут возбуждаться и при меньших энергиях). В большинстве случаев спектры энергий осцилляторов превышают потенциал ионизации. Однако не все состояния с энергиями, превосходящими потенциал ионизации, непременно приводят к ионизации молекулы. «Сверхвозбужденные состояния» могут рассеивать энергию при внутримолекулярных изменениях или при диссоциации молекулы на два радикала. Только часть спектра, обозначаемая как «ионизация», относится к тем переходам, которые всегда приводят к потере электрона.

Знание спектра возбуждения для биологически активных макромолекул позволило бы оценить распределение и частоту переносимых к молекуле дискретных порций энергии. Теоретический расчет сил осцилляторов многоатомных молекул, как уже говорилось, задача практически невыполнимая. Отсутствуют и экспериментальные исследования, которые позволили бы представить спектр возбуждения макромолекул. Величину «пакетов энергии», передаваемых макромолекуле в результате одиночного взаимодействия, можно получить путем прямого измерения потери энергии электронами, проходящими через тонкие пленки, для которых вероятность более чем одного взаимодействия с электроном крайне мала. Для этого электроны с энергией 20 кЭв пропускали через тонкие пленки полимера (формваровая фольга) толщиной 13 нм и слои ДНК толщиной 200 нм. Исходя из величины неупругого рассеяния определяли частоту различных событий потери энергии электроном (рис. III-11). Вероятность более чем одного события потери энергии при прохождении электроном слоя толщиной в 13 нм очень мала. Поэтому данные рис. Ш-11,1 можно рассматривать как меру распределения частоты различных событий потери энергии. Из рисунка видно, что чрезвычайно редко величина потери энергии меньше 10 эВ. С наибольшей частотой при каждом первичном взаимодействии переносится пакет энергии в 22эВ, в то время как среднее количество потери энергии на одно событие взаимодействия 60 эВ.

Спектры потери энергии в формваре и ДНК качественно схожи. Различие, вероятно, связано с неодинаковой толщиной пленок (технически очень трудно получить пленки ДНК тоньше 200 нм). При такой толщине слоя ДНК можно ожидать более одного события потери энергии. Следует также учесть, что оба рассматриваемых спектра включают и небольшое число лобовых соударений. Если сделать необходимые поправки на эти эффекты, то мы получим спектр возбуждения ДНК, который позволил бы оценить спектр сил осцилляторов этой молекулы.

Итак, прямые эксперименты показывают, что на одно событие потери энергии к макромолекулам в среднем переносится 60 эВ энергии излучения. Эта величина значительно превосходит потенциал ионизации молекулы. Перенос такого большого количества энергии с высокой вероятностью переводит молекулу в иоди-зированное состояние. Помимо ионизированных возникают возбужденные и сверхвозбужденные молекулы. Относительный вклад ионизации и возбуждения в биологический эффект можно оценить некоторыми специальными методами.

ПЕРВИЧНЫЕ ФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ,  ПРИВОДЯЩИЕ К ИНАКТИВАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ ПРЯМОМ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЯ

Обратимся еще раз к рис. III—11. Возбуждение различных осцилляторов приводит к появлению возбужденных, сверхвозбужденных и ионизированных молекул. Теоретический расчет выхода этих первичных продуктов требует знания действующего спектра, сечения возбуждения и ионизации и представляет пока еще не решенную задачу. Метод «оптического приближения» позволяет оценить соотношение этих продуктов исходя из распределения спектра сил осциллятора молекулы. Информацию о распределении силы осциллятора молекулы можно получить на основании косвенных экспериментов с использованием различных физических методов.

Образованием первичных продуктов, т. е. возбужденных, сверхвозбужденных и ионизированных молекул, неравномерно распределенных в пространстве, заканчивается первая, или физическая, стадия действия излучения.