Глава 2. ЗАВИСИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТ ПОГЛОЩЕННОЙ ДОЗЫ ИЗЛУЧЕНИЯ

Глава 2. ЗАВИСИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТ ПОГЛОЩЕННОЙ ДОЗЫ ИЗЛУЧЕНИЯ

ЗАВИСИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТ ПОГЛОЩЕННОЙ ДОЗЫ ИЗЛУЧЕНИЯ. ПРИНЦИП ПОПАДАНИЯ И КОНЦЕПЦИЯ МИШЕНИ

Исследования, выполненные «а начальном этапе развития радиобиологии, позволили в общих чертах установить качественную картину лучевого поражения клеток и разнообразных многоклеточных организмов. Экспериментаторы с большим интересом подвергали биологические объекты «рентгенизации» или действию эманации радия. Они отмечали, что в результате облучения угнетается ‘клеточное деление, возникает аномалия роста и развития, происходит атрофия кроветворных органов, дегенерация семенников и яичников, гибель различных организмов, включая млекопитающих. В этот период установлено бластомогенное действие радиации и другие отдаленные эффекты облучения.

Строгие количественные эксперименты впервые были проведены в конце 20-х гг. Этому способствовало два обстоятельства. Во-первых, широкое распространение получают ионизационный метод дозиметрии излучения и международная единица экспозиционной дозы — рентген (Р); облучение экспериментальных объектов строго дозируется, и условия опыта могут многократно воспроизводиться. Во-вторых, для количественных экспериментов исследователи стали использовать клоны генетически однородных ‘клеток, вирусные частицы, препараты макромолекул, т. е. такие системы, в которых легко определить реакцию единичного объекта на действие данной дозы излучения.

На рис. II-1 представлены результаты некоторых таких работ. Зависимость биологического эффекта от дозы облучения отражают кривые «доза—эффект». Для построения этих кривых объекты облучают в широком диапазоне доз, после действия каждой дозы определяют долю особей, сохранивших исходные свойства, по отношению к их общему числу до облучения.

Кривые «доза—эффект» (рис. II-1, А—Г) построены авторами на основании экспериментов с простейшими, яйцами аскариды, вирусами, ферментами. Разнообразны объекты, различны диапазоны использованных доз излучения, но во всех случаях наблюдается интересная закономерность: при самых малых дозах облучения уже обнаруживаются инактивированные клетки, вирусные частицы или макромолекулы (все кривые надежно экстраполируются к нулевой точке), а при дозах, в сотни и тысячи раз больших, все еще удается обнаружить объекты, сохранившие исходные биологические свойства, т. е. не пораженные излучением.

Обнаруженный ,в строгих количественных экспериментах ха^ рактер зависимости биологического эффекта от дозы облучения трудно объяснить, оставаясь в рамках только бирлогических закономерностей, т. е. исходя лишь из особенностей объекта (клетки, вируса или фермента). Отсутствие нижнего порога на кривой «доза—эффект» означает, что в пределах Генетически однородной популяции существуют объекты, которые гибнут при самых малых дозах, тогда как другие выживают при действии огромных доз облучения. Естественная вариабельность (минималь-

Глава 2. ЗАВИСИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТ ПОГЛОЩЕННОЙ ДОЗЫ ИЗЛУЧЕНИЯ

Доза у-лучей.Х 102Гр Доза рентгеновских лучей,X ю’Гр

Рис. II—1. Зависимость биологического эффекта or дозы облучения: А — гибель инфузорий Colpidium colpoda через 2 часа после облучения (Кроутер, 1926), Б — гибель яиц аскариды после облучения в аэробных условиях (Браун, Хольтузен, 1929), В — инактивация вируса табачной мозаики у-лучамн (Ли, Смит, 1940), Г — инактивация сухой рибо-нуклеазы (Ли др., 1944)

ная для клеток одного клона) не может служить причиной этого эффекта. Еще труднее предполагать, что среди макромолекул рибонуклеазы (рис. II-1, Г), обладающих одинаковыми физико-химическими свойствами, одни молекулы утрачивают каталитическую активность при действии малых доз, а другие сохраняют активность при действии тысячекратно превосходящих доз лишь в силу особенностей самого объекта, подвергающегося облучению. Объяснение, вероятно, следует искать в особенностях воздействия — ионизирующего излучения.

Рассматриваемые кривые «доза—эффект» показывают, какая доля объектов инактивируется при поглощении системой определенного количества энергии ионизирующих излучений. Предста-

Цим, что эта же система (суспензия клеток, препарат вирусных частиц или лЦкромолекул) получает энергию иным путем, например за счет нагревания от какого-либо источника тепла. В этом случае кривая Чдоза—эффект» примет иной вид. Вплоть до некоторой температуры Т°i не обнаруживаются инактивированные объекты, после эхрй пороговой температуры число пораженных объектов возрастает до максимального значения, и, если процесс термоинактивации Необратим, при достижении некоторой температуры Т°2 мы не обнаружим ни одного вируса, макромолекулы и тем более клетки, оставшихся непораженными. Таким образом, решающее влияние на I характер дозной кривой оказывают не особенности объектов, а способ сообщения энергии. В опытах по термоинактивации, о которых шла речь, энергия от источника тепла сообщалась всем объектам равномерно и одинаково за счет теплопроводности воды или воздуха (в жидких или сухих препаратах соответственно). Ионизирующие частицы, напротив, сообщают системе энергию дискретными порциями, и процесс передачи энергии носит статистический характер. Поэтому среди совокупности облучаемых микроструктур одни из них с определенной вероятностью поглощают энергию излучения, тогда как другие вообще «не знают», что облучение имело место. Такие представления, основанные на фундаментальных физических концепциях о механизме взаимодействия ионизирующих излучений с веществом, позволяют объяснить количественные закономерности, наблюдаемые в радиобиологических экспериментах.

Ф. Дессауэр в 20-е гг. подошел к проблеме биологического действия ионизирующей радиации, исходя из физической природы излучения. Выдвинутая им гипотеза «точечного нагрева» основывалась на- следующих положениях4:

1 — ионизирующие излучения обладают очень малой объемной

плотностью по сравнению с видимым или ультрафиолетовым светом энергетически эквивалентной дозы;

2 — фотоны рентгеновского или у-излучения, ускоренные элек

троны или тяжелые заряженные частицы обладают огромной энергией, величина которой значительно превосходит энергию любой химической связи;

3 — облучаемый биологический объект, например клетка, со

стоит, с одной стороны, из относительно безразличных и, с другой — весьма существенных для жизни микрообъемов и структур;

4 — в облучаемом объекте при поглощении относительно не

большой общей энергии в отдельных случайных и ред-корасположенных микрообъемах оставляются настолько большие порции энергии, что их можно сравнить с микролокальным нагреванием и они могут производить почти любые узколокальные изменения в веществе

5 — так как распределение «точечного теплая является чкс-то статистическим, то конечный эффект з клетке будет зависеть от случайных попаданий дискретных порций энергии в жизненно существенные микрооб^емы внутри клетки. С повышением дозы увеличивается вероятность таких попаданий, и наоборот, при понижении дозы вероятность снижается. Из этого следует, 4to любая самая малая доза может соответственно с м^лой вероятностью и, следовательно, малой частотой вызьфать экстремальный биологический эффект (например, гибель или инактивацию ;клетки), но даже при очень вькюкой дозе могут с малой вероятностью и малой частотой сохраниться отдельные неповрежденные клетки.

В последующих работах, выполненных Дж. Кротутером, Д. Ли, К. Циммером, Н. В. Тимофеевым-Рессовским и др., были предложены и успешно использованы для анализа радиобиологических эффектов принцип попадания и концепция мишени (или мишеней).

В общем виде количественный анализ, основанный на принципе попадания, состоит в том, что полученные в эксперименте кривые «доза—эффект» интерпретируют на основании следующих физических принципов:

1 — ионизирующие излучения переносят энергию в дискрет

ном виде;

2 ’— акты взаимодействия (попадания) не зависят друг ог

друга и подчиняются пуассоновскому распределению;

3 — исследуемый эффект наступает, если число попаданий в

некоторую чувствительную область, так называемую мишень, равно по крайней мере п.

Рассмотрим простейший случай «одноударного процесса», когда попаданием считают одиночный перенос некоторого минимального количества энергии. Энергия попадания определяется характером повреждения и спецификой облучаемой системы, т. е. тестируемый эффект наступает лишь тогда, когда определенное минимальное количество энергии поглощено чувствительной областью — мишенью.

Представим, что облучаемая система состоит из N0 объектов, каждый из которых обладает мишенью сечением 5 и объемом у. Пусть для инактивации объекта достаточно, чтобы трек плотноио-низирующей частицы прошел через сечение мишени 5; такое событие будем именовать попаданием. Это предположение имеет смысл. Так, например, а-частица с энергией 2,5 МэВ (табл. 1-7) образует около 3000 пар ионов на 1 мкм пути. Если пренебречь неравномерностью распределения ионов вдоль трека, то даже при толщине мишени Ю-3 мкм с большой вероятностью в пределах мишени, через которую проходит трек частицы, возникнет несколько ионизаций. Если траектории частиц распределяются по поперечному сечению объекта случайным образом и не зависят друг от друга, то вероятность одного, двух…… п попаданий в мишень, находящуюся в пределах объекта, описывается соотношением

= (1М>

где а — среднее число попаданий в мишень. Если D — среднее-число частиц, пролетающих через единичную площадку сечением S, a S — сечение мишени, то

a=SD. (11-2)

При как угодно малой дозе излучения существует вероятность прохождения частицы через одну из мишеней. С увеличением потока частиц (т. е. с ростом дозы излучения) возрастает число мишеней, претерпевших попадание, т. е. величина D пропорциональна поглощенной дозе излучения.

Если N0 — общее число объектов в облучаемой системе, а N — число объектов, сохранивших после облучения исходные свойства (т. е. «выживших»), то величина N/N0 соответствует вероятности непопадания (п = 0). Из уравнения (II-1) для случая я = 0 (учитывая, что 0! = 1) получим

N/N0 = {S%fSD = (П-3)

При некоторой дозе облучения выполняется условие SD = = 1. Это соответствует случаю, когда в среднем число попаданий равно числу мишеней. В действительности же часть попаданий испытали уже однажды пораженные мишени, а некоторые не претерпели ни одного попадания. Согласно статистике Пуассона при SD= 1 реально поражается только 63% мишеней, а 37% оказываются непораженными. Действительно, подставив в уравнение (II-3) значение SD= 1, получим

N/N0 = e~SD = е-1 = 0,37. (II-4)

Отношение N/N0 легко определить в эксперименте: это доля «выживших» объектов по отношению к их общему числу до облучения. Узнав, при какой дозе облучения выживает 37% объектов, т. е. N/Nq—0,37 (эту дозу излучения обозначают символом D3? и называют 37%-ной, инактивирующей или средней летальной), мы можем определить сечение мишени из соотношения

SZ>37= 1, или 5=1/D37. (II-5)

На рис. II-2 (А—В) представлена схема, иллюстрирующая зависимость числа пораженных мишеней от дозы облучения. Из рис. II-2, А видно, что даже при малой дозе облучения некоторое число частиц проходит через мишени и вызывает их инактивацию, а с ростом дозы число пораженных объектов возрастает резко,.

почти линейно, а затем все более вероятно повторное прохождение частиц через однажды пораженные мишени. При дозе D37 общее число частиц соответствует числу мишеней (SZh-H), но 37% объектов остаются непораженными, так как некоторые из 63% мишеней испытали по два и более попаданий (рис, II-2,Б). Даже при очень большой дозе облучения все же какое-то число объектов оказалось не пораженным облучением (рис. II-2,В). Графически зависимость доли выживших от величины дозы выражается зкспонентой (рис. II-2, Г).

N/N0 = e~SD = e~DD». (II.6)

Аналогичные рассуждения можно использовать для анализа «одноударных процессов» при действии рентгеновского или у-излучения, вызывающего редкорасполо-жеиные акты ионизации по всему объему облучаемого объекта. В этом случае можно установить еще один важный параметр мишени — ее объем.

Теоретические положения теории мишени, основанные на предположении об «одноударности процесса» попадания, предсказывают экспоненциальную зависимость «доза—эффект». В реальных: условиях эксперимента такую зависимость наблюдали при облучении макромолекул, вирусов, бактериальных спор, некоторых одноклеточных организмов (см., например, рис. II-1, А—Г). Чтобы выявить существование экспоненциальной зависимости эффекта облучения от поглощенной дозы, поступают следующим образом. Объекты’облучают в широком диапазоне доз, для каждой дозы определяют долю выживших N/N0 и находят значение натурального логарифма этой величины. Если на графике, отражающем зависимость In Nf’N0 от поглощенной дозы, все точки укладываются на, прямую, значит выполняется соотношение

lnN/N0 =—aD, или N/N0 = e-a°. (11-10)

На рис. II-4 представлена кривая «доза—эффект», полученная преобразованием в полулогарифмических координатах кривой из рис. П-1,В. Видно, что доля вирусов, сохранивших исходную активность, экспоненциально зависит от дозы излучения, так как все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. выполняется уравнение (II-10).

Теоретические кривые выживаемости для объектов, ииактивируемых в результате нескольких попаданий (по Дессауэру, 1954): а — в полулогарифмическом масштабе, б—в обычном масштабе. Цифры на кривых означают «ударность» процесса инактивации

мента предыдущей ионизации, ,ни от времени, отделяющего ее от последующей ионизации. Следовательно, эффект данной дозы должен определяться только ее величиной (т. е. числом возникших актов ионизации); интенсивность излучения и распределение дозы во времени не должны играть никакой роли.

Выполнение второго требования означает, что плотноионизи-рующие излучения менее эффективны, чем редкоионизирующие. Действительно, если одиночной ионизации достаточно для возникновения тестируемого эффекта, то частицы, производящие большое число ионов на единицу пути, вызовут в пределах мишени множество «ненужных» ионизаций. Редкоионизирующие излучения генерируют сгустки ионов, значительно удаленные друг от друга, и вероятность возникновения нескольких ионизаций в пределах мишени малого размера незначительна. Величина поглощенной дозы определяет общее число ионизаций, произведенных данным видом излучения в единице объема. При одноударном процессе большинство ионизаций, вызванных плотноионизирую-щим излучением, «бесполезно». Поэтому при равной дозе, т. е. при равном общем числе ионизаций, редкоионизирующие излучения окажутся более эффективны.

Напротив, если тестируемый эффект наступает вследствие большого числа ионизаций в пределах мишени (многоударный механизм инактивации), то частицы с высокой плотностью ионизации окажутся значительно эффективнее, чем редкоионизирующие.

Кривые «доза—эффект» при многоударном механизме инактивации отличаются от экспоненциальных дозовых кривых, наблюдаемых в случае одноударного процесса. ,В полулогарифмическом масштабе семейство дозовых кривых для случая п = 2, 3, …, k представлено на рис. II-5. Чем больше «ударность» мишени, тем заметнее «плечо» — начальный, более горизонтальный участок кривой. Вслед за плечом следует переход к прямолинейному участку, наклон которого совпадает с наклоном соответствующей одно-ударной кривой. Вид дозной кривой при многоударном механизме инактивации определяется тем, что при малых дозах лишь небольшое число объектов может испытать требуемое число попаданий (k), а все остальные — не более (k—1) попаданий. По достижении (А—1) попаданий во все или большинство объектов возникает ситуация, при которой последнее, й-тое, попадание приводит к тестируемому эффекту. Начиная с этой дозы кривая принимает вид, характерный для одноударного процесса.

Формально такие кривые могут быть получены суммированием всех объектов, получивших 0, 1, 2, …, (п—1) попаданий; согласно распределению Пуассона их точное число выражается соотношением (II-1), а доля выживших, т. е. претерпевших от 0 до (п—1) попаданий, определяется следующей формулой:

п—1

jV/iV0 = e-aD ^ , (II-11)

k ~о

где N — число выживших, a N0 — общее число индивидов в облученной совокупности объектов. Уравнение для одноударного процесса легко получить из (II-11), подставив п = 0.

На основании принципа попадания и концепции мишени можно анализировать кривые «доза—эффект», полученные в эксперименте. В зависимости от вида объекта и характера излучения получают различные дозные кривые — от простых экспоненциальных до сигмоидальных с различной величиной плеча. Наиболее надежно поддаются формальному анализу одноударные радиобиологические реакции, в которых попаданием служит одиночная ионизация или рой ионов в пределах мишени. В этом случае, располагая кривыми «доза — эффект» для излучений с различными значениями ЛПЭ, можно рассчитать размеры и число мишеней, отражающие размеры и число тех элементарных биологических структур, поражение которых вследствие ионизации приводит к регистрируемому биологическому эффекту. Подобное применение теории попадания позволило впервые определить размеры некоторых макромолекул, вирусов, генов, получить сведения о внутренней структуре бактериальных спор и т. д.

Кривые «доза—эффект», полученные при облучении клеток, как правило, не удовлетворяют требованиям одноударного процесса. Для интерпретации кривых «доза—эффект» с различной величиной плеча используют сложные математические построения, основанные на различных гипотетических моделях. Ранее мы упоминали, что такого рода кривые можно объяснить многоуд арностью процесса. Другая возможность формального описания сигмоидальных кривых «доза—эффект» состоит в том, что предполагают наличие в объекте нескольких чувствительных объемов —» мишеней — и что реакция наступает лишь после того, как все они получили определенное число попаданий. Согласно теории вероятностей уравнение, описывающее «кривую гибели» для системы из т мишеней, имеет вид

N+!N0= (l (И-12)

k=0

где N+ соответствует числу нежизнеспособных объектов. Эта формула может быть распространена и на описание мишени с варьирующим размером v{ и неодинаковым числом попаданий, необходимых для инактивации различных мишеней щ:

т>, п—1

N+IN0 = П 0 — ад, где Bt = £ JSd£-. (II-13)

1=1 ‘ fe=0

Такие сложные выражения теряют свое практическое значение. На основании этих уравнений можно построить теоретические кривые «доза—эффект», однако с большой точностью сопоставлять их с кривыми, получаемыми в реальном эксперименте, не представляется .возможным. Еще более сложно вычислить на основании экспериментальных дозных кривых параметры мишени — и.

пит. Иначе говоря, математический аппарат теории попадания и мишени не позволяет определить размеры и форму тех элементарных биологических структур, которые отвечают за биологические эффекты, описываемые дозными кривыми, более сложными, чем одноударная кривая. Помимо чисто технических трудностей существует целый ряд теоретических ограничений для использования формальных построений теории попадания в анализе сложных радиобиологических процессов. При облучении растворенных объектов попадание ионизирующей частицы в мишень вносит меньший вклад в поражающее действие излучения, чем активные продукты, возникающие в окружающем растворителе (радикалы воды). При облучении клеток биологический эффект может быть обусловлен попаданием в различные мишени, параметры которых зависят от физиологического состояния объекта. В каждом отдельном случае поражение определенной структуры может вызываться различными по своей физической природе событиями попадания. В результате мы будем наблюдать появление у клеток генетически однородной популяции одного и того же тестируемого эффекта вследствие различных первичных повреждений. И наконец, трудно ожидать, что клетка «пассивно» воспринимает нанесенные повреждения. За счет работы репаративных или компенсаторных систем некоторая часть повреждений может быть восстановлена. Вследствие этих и ряда других причин наблюдают самые разнообразные формы кривых «доза—эффект», их вид может меняться в зависимости от физиологических особенностей объекта и условий, в которых проводится их облучение.

* * *

Развитие количественного направления в радиобиологии привело к накоплению таких экспериментальных данных, которые не могли быть истолкованы в рамках чисто биологических феноменов. Отсутствие порога на кривых «доза—эффект», полученных в опытах по облучению макромолекул, вирусов, бактерий, изолированных клеток, указывало на то, что любая как угодно малая доза облучения может вызвать появление у некоторой части особен наблюдаемой реакции. В то же время поглощение облучаемой системой очень больших доз излучения не приводило к инактивации всех объектов, некоторые из них сохраняли исходные биологические свойства. Следовательно, с ростом дозы повышается не столько степень проявления эффекта у отдельных особей облучаемой популяции, сколько количество (доля) объектов, реагирующих данным образом, т. е. возрастает вероятность проявления данной реакции на облучение.

Для интерпретации вероятностного характера биологического действия ионизирующего излучения были использованы фундаментальные физические концепции о вероятностном характере взаимодействия квантов высоких энергий и ускоренных заряженных частиц с веществом. При каждом акте взаимодействия к атому или молекуле переносится такая дискретная порция энергии, которая может заведомо привести к разрыву любой химической связи. Поэтому можно было рассматривать каждый акт такого одиночного переноса энергии как событие попадания, приводящее к поражению определенной структуры. Акты попадания статистически распределяются по всей облучаемой системе, так же статистически будут распределены микрообъемы, поврежденные излучением. Если часть микрообъемов — это мишени, ответственные за наблюдаемую реакцию, то на основании соответствующих математических построений можно оценить их параметры — сечение, объем, молекулярную массу.

Подобные соображения стимулировали большое число исследований, посвященных формальному анализу экспериментальных кривых «доза—эффект». Хотя такой анализ не может раскрыть последовательность физико-химических процессов, приводящих к поражению мишени в результате попадания, он позволяет получить важные сведения о характере первичных физических событий (попаданий) и оценить параметры структур, ответственных за наблюдаемый биологический эффект.