ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ

ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ

Прямое действие ионизирующей радиации на макромолекулы исследуют на обезвоженных или кристаллических препаратах ферментов и нуклеиновых кислот. В этом случае большинство молекул инактивируются в результате прямого поглощения энергии излучения*._

1 Даже при облучении высокоочищеиных препаратов в высоком вакууме наличие только прямого действия маловероятно: активные продукты, возникаю-

Прямое действие излучения на ферменты

Схема эксперимента по определению числа инактивированных молекул фермента при действии данной дозы состоит в том, чгс» ампулу с гомогенным препаратом (сухим или кристаллическим* подвергают облучению, а затем сопоставляют активность опытна го и контрольного образцов. Путем соответствующего пересчета можно перейти от доли инактивированных молекул (йли процента инактивации) к истинному числу молекул фермента, инактивн-рованные данной дозой радиации. Используя соответствующие биохимические методы, можно дифференциально оценить изменение различных функциональных свойств облученного фермента — каталитической активности, субстратной специфичности, аллостери-ческого регулирования и т. д.

На рис. Ш-1,А, Б представлены результаты одного из экспериментов с кристаллической рибонуклеазой. В широком диапазоне доз излучения оценивали каталитическую активность и субстратную специфичность облученного фермента.

Так как деградация РНК под действием рибонуклеазы осуществляется в два этапа (вначале расщепляется фосфодиэфирная связь в РНК и образуется циклический диэфир, а на второй стадии пиримидин-2′, З’-циклическая фосфатная связь гидролизуется донуклеотид-3-фосфата), то, используя РНК в качестве субстрата, можно исследовать общую реакцию, а с помощью цитидин-2′, 3′-циклофосфата — только вторую реакцию. Одинаковую инактивацию облученной РНКазы наблюдали при использовании обоих субстратов (рис. III-1), т. е. в равной мере поражаются обе функциональные единицы фермента.

Зависимость эффекта от дозы облучения экспоненциальна. При самых малых дозах обнаруживаются молекулы фермента, утратившие способность расщеплять субстраты обоих типов; с ростом поглощенной дозы число таких молекул возрастает вначале резко, почти линейно, а затем мы видим, как значительному приращению дозы соответствует лишь небольшое увеличение доли инактивированных молекул. Для проверки экспоненциального характера зависимости «доза—эффект» необходимо преобразовать кривую III-1, А в полулогарифмических координатах, ,как это сделано на рис. III-1, Б (по оси ординат откладывается не доля ,молекул, сохранивших исходную активность, а натуральный логарифм этой величины). Все экспериментальные точки укладываются на прямую, проходящую под углом к оси ординат, следовательно, In N/N0 = —kD или N/N0 = e-hD (см. уравнение II-9).

Экспоненциальная зависимость «доза—эффект» обнаружена в экспериментах по лучевой инактивации различных ферментов

щие при поражении одних молекул, могут индуцировать структурные изменения среди своего ближайшего окружения.

(рис. Ill-2) и может рассматриваться как общая закономерность прямого действия радиации на ферменты.

Сравнивая кривые «доза—эффект», можно сопоставить радиочувствительность различных ферментов. Из рис. III-2 видно, что для получения сравнимой инактивации изученных ферментов требуются существенно различающиеся дозы. Обычно в качестве критерия радиочувствительности выбирают такую же дозу излучения,

которая необходима для инактивации 63% молекул в облученном препарате фермента. Так как при этом 37% молекул сохраняют на-тивные свойства, эта доза получила название «доза 37%-ной сохранности», или доза £>37. По рис. III-2 1 2 3 4 5 6 можно установить, что для инвер-

Доэа облучения, ХИРГр 100,- Б

ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛДоза облучения, X 10

Рис. Ill—2. Радиочувствительность ряда ферментов, облученных Y-лучами в вакууме

ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ

1 2 3 4 5 6 7 8

Доза облучения, X 10′^Гр

Рис. Ill—1. Инактивация РНКазы рентгеновскими лучами. Ферментативная активность определялась с помощью двух различных субстратов: 1 — ДНК; 2 — цитидин-2′,3′-

циклофосфата (по Юнгу и тазы D37 в данных условиях около Дертингеру, 1973); А — зави- 80 кГр а я рибонуклеазы — симость «доза — эффект» вы- г -

ражена в линейных координа- 280 кГР- т- е- ПРИ одинаковой дозе тах; Б — эти же данные пред- первый фермент поражается со ставлены в полулогарифмиче- значительно большей вероятностью.

ских координатах, эксперимен- Это может быть связано с различ-тальные точки укладываются

на прямую иыми размерами макромолекулы,

особенностями аминокислотного состава, характером миграции энергии или другими причинами, которые должны быть установлены в ходе биофизического анализа.

Известно, что функциональные свойства фермента определяются его различными структурными участками. Так как поглощение энергии излучения может приводить к различным типам структурного повреждения, следует ожидать, что не все функции фермента подавляются радиацией в равной степени. В табл. II1-1 сведены результаты различных авторов, которые подтверждают такую возможность. В опытах с рибонуклеазой обнаружено, что об-

ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛУЧЕВОГО ПОРАЖЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ

Таблица III-l

Радиочувствительность функций, определяющих биологическую активность ферментов

(по Окада, 1972)

Фермент Радиочувствительность функций, связанных с ферментативной активностью (сопоставляются соответствующие величины доз D37)
Химотрипсин Трипсин

Глутаматдегидрогеназа

Рибонуклеаза

Аспартаттранскарбамо-илтрансфераза

зстераза протеаза связывание диизопропилфосфата ]> уменьшение максимальной скорости ^увеличение константы Михаэлиса — Ментен* протеаза эстераза

уменьшение максимальной скорости и увеличение константы Михаэлиса — Ментен поражение активного центра и способности связывать кофермент уменьшение максимальной скорости; константа Михаэлиса — Ментен без изменения поражение активного центра инактивация участка инги-бирования по принципу обратной связи (аллостерические свойства)

* Более высокая радиочувствительность (т. е. меньше дозы D37) обозначена символом >. Например, эстераза > протеаза означает, что эстеразиая активность фермента более радиочувствительна, чем протеазиая.

лучение приводит к снижению максимальной скррости реакции, а величина константы Михаэлиса—Ментен остается без изменения. Это означает, что число каталитически активных молекул снижается в облученном препарате, однако пораженные молекулы сохраняют сродство к субстрату. Вероятно, возникающие структурные поражения затрагивают активный центр, но не препятствуют взаимодействию фермента со специфическим субстратом. В случае с трипсином протеазная активность поражается в большей мере, чем эстеразная, т. е. в результате облучения возникают повреждения главным образом в тех структурных звеньях, которые определяют протеазную активность фермента. Если ионизирующие излучения ‘в состоянии вызывать специфические структурные повреждения в молекуле фермента и приводить к определенному изменению его функциональных характеристик, то с помощью радиационного воздействия можно исследовать причинную связь между структурой и функцией фермента.

Рассмотрение феноменологии лучевого поражения ферментов позволяет заключить, что в результате прямого действия излучения возникают различные нарушения функциональных свойств фермента; наблюдается экспоненциальная зависимость биологического эффекта от величины поглощенной дозы, т. е. с увеличением поглощенной дозы излучения доля макромолекул, сохранивших нативные свойства, убывает по закону e hD, где k — константа, a D — поглощенная доза. Облученный фермент может утрачивать одни функциональные свойства при сохранении других, т. е. наблюдается неодинаковая радиочувствительность различных биологических свойств фермента; по одному и тому же критерию, например каталитической активности, различные ферменты обладают нео ди на ковой р а ди очу ветви тел ьностью.